Израильские ученые разработали метод массового производства ферментов
Сегодня уже ясно, что ферменты могут преобразовать химическую промышленность, обеспечивая экологически чистые альтернативы множеству ключевых процессов. Эти белки действуют как биологические катализаторы, и с помощью молекулярной инженерии они могут существенно ускорять темпы естественных реакций. Типичная молекула фермента может преобразовать 1000 молекул своего субстрата — вещества, на котором активен этот фермент — за одну секунду.
Разработанный в Институте Вейцмана метод CADENZ создает тысячи новых ферментов из простых блоков, сообщили в пресс-службе Научного Института им. Вейцмана.
Так, специализированные ферменты могут позволить экологически чистое производство лекарств, они также могут безопасно расщеплять загрязняющие вещества, очищать сточные воды и перерабатывать сельскохозяйственные отходы, превращая их в биотопливо или корм для скота.
Новое исследование научного Института им. Вейцмана, опубликованное в журнале Science, приближает эти идеи к реальности. В своем отчете исследователи во главе с профессором Сарелем Флейшманом с отделения биомолекулярных наук раскрывают вычислительный метод разработки тысяч различных активных ферментов с беспрецедентной эффективностью путем их сборки из инженерных модульных "строительных блоков".
Биохимики обычно разрабатывают новые ферменты, случайным образом изменяя ДНК ферментов, уже существующих в природе, а затем проверяя полученные варианты на желаемую активность. Ясно, что такой процесс может занимать очень много времени. Группе Флейшмана пришла в голову идея создания большого количества самых разнообразных ферментов путем расщепления природных ферментов на составные фрагменты, которые затем можно изменять и рекомбинировать различными способами.
Вдохновением для нового подхода стала наша собственная иммунная система, которая способна производить миллиарды различных антител из элементов, кодированных относительно небольшим количеством генов. Проф. Флейшман отмечает, что «антитела — это единственное семейство белков в природе, которые производятся таким модульным образом. Их огромное разнообразие достигается за счет рекомбинации уже существующих генетических фрагментов, подобно тому, как новый вид электронного устройства собирается из ранее существовавших транзисторов и процессоров».
Но способны ли ферменты, подобно антителам, образовываться из разработанных в лаборатории модульных фрагментов, которые объединяются в более крупные структуры?
Розали Липш-Соколик, аспирантка, руководившая исследованием в лаборатории Флейшмана, начала экспериментировать с семейством из нескольких десятков ферментов, расщепляющих ксилан, обычный компонент клеточных стенок растений. Она указывает, что «если нам удастся повысить активность этих ферментов, их можно будет использовать для расщепления растительных соединений, таких как ксилан и целлюлоза, на сахары, которые, в свою очередь, могут помочь в производстве биотоплива. Например, вместо того, чтобы утилизировать сельскохозяйственные отходы, мы сможем превращать их в источник энергии».
Липш-Соколик разработала алгоритм, который использует основанные на физике расчеты структур белков вместе с новой моделью машинного обучения. Алгоритм разбил каждый из различных вариантов последовательностей ферментов, разлагающих ксилан, на несколько фрагментов, а затем в эти фрагменты ввел десятки мутаций — все таким образом, чтобы максимизировать потенциальную совместимость различных фрагментов. Затем он собрал фрагменты в различные комбинации и отобрал миллион последовательностей кодируемых ферментов, которые показались ему достаточно стабильными. Синтезировав эти ферменты, исследователи обнаружили, что 3000 из них действительно оказались активными. Всего 0,3% успеха - это немного, но надо помнить, что в традиционных исследованиях дизайна белков ученым удается распознать около дюжины активных ферментов - а тут они получили сразу несколько тысяч!
На этом этапе исследователи поставили перед собой новый вопрос - какие молекулярные качества отличают активные ферменты от неактивных?
Используя инструменты машинного обучения, Липш-Соколик изучила около сотни характеристик ферментов и использовала десять наиболее многообещающих из них для создания прогноза активности. Когда она включила этот прогноз в свой алгоритм и повторила эксперимент с ферментами, расщепляющими ксилан, то во втором поколении она получила целых 9000 ферментов, расщепляющих ксилан, и еще 3000, способных расщеплять целлюлозу - итого 12000 активных ферментов! Такое десятикратное увеличение вероятности успеха стало беспрецедентным достижением в истории дизайна белков во всем мире.
Тысячи этих активных вариантов оказались исключительно разнообразны с точки зрения как их последовательности, так и структуры, и это позволяет предположить, что они могут выполнять широкий спектр новых функций.
«Когда вы можете создавать ферменты с таким высоким уровнем активности, используя полностью автоматизированный и абсолютно надежный метод - это действительно хорошая новость», — говорит Липш-Соколик. Проф. Флейшман отмечает, что новый метод, который ученые назвали CADENZ (английская аббревиатура фразы "Комбинаторная сборка и дизайн ферментов"), теоретически может быть применен к любому семейству белков, и ученые Института Вейцмана уже изучают его применение для создания новых улучшенных антител или вариантов флуоресцентных белков, широко используемых в качестве меток в биологии. "Белковая инженерия становится центральной частью экономики и здравоохранения: промышленные ферменты — это белки; антитела и вакцины также являются белками. Нам нужно иметь возможность оптимизировать их и генерировать новые надежным и практичным способом", - говорит он.
Израильские ученые раскрывают факторы риска возрастной слепоты
Исследователи Тель-Авивского университета определили новый генетический фактор риска сложного заболевания глаз AMD (возрастная дегенерация желтого пятна), которое считается основной причины потери зрения в пожилом возрасте.
Ученым удалось впервые опознать белки, играющие ключевую роль в развитии и функционировании ткани, поражаемой этим недугом, найти их точные участки в геноме и доказать связь между вариациями в этих геномных областях и риском развития AMD.
Исследованием руководили профессора Рут Эшери-Падан и профессор Ран Элькон и их сотрудники - Мазаль Коэн Гулкар, Наама Месика, Ахувит Давид и Май Эшель - с кафедры молекулярной генетики и биохимии человека на медицинском факультете Тель-Авивского университете. Результаты их работы опубликованы в журнале PLOS Biology.
Проф. Эшери-Падан: «Одной из самых серьезных проблем в генетических исследованиях сегодня является расшифровка генетических механизмов сложных заболеваний, вызванных комбинацией нескольких различных генетических факторов и факторов окружающей среды. Речь идет о диабете, болезнях кишечника, различных психических заболеваниях и других патологиях. К ним относится и болезнь AMD, которая вызывает дегенерацию центральной части сетчатки — основную причину потери зрения в пожилом возрасте в развитых странах».
«AMD имеет значительный генетический компонент. Исследования, сравнивавшие геномы людей с AMD и без нее, обнаружили различия в нескольких областях генома, вероятно, связанные с факторами риска развития AMD. Однако эти различия были обнаружены не в каком-либо конкретном гене, а скорее в обширных районах, объединяющих целый ряд генов, функции и способы работы которых до сих пор в значительной степени неизвестны. До сих пор никто не смог найти в этих участках генома специфические особенности, которые можно было бы определить как конкретный фактор риска. Наше исследование было направлено на решение этой проблемы».
Ученые уделили особое внимание клеткам слоя ткани, называемого пигментированным эпителием сетчатки (ПЭС), который поддерживает фоторецепторы в сетчатке и необходим для их начального развития, а также для их выживания на протяжении всей жизни человека. По словам исследователей, именно эта ткань поражается AMD на самой ранней стадии болезни.
«Во-первых, мы хотели понять генетический механизм, который активирует и регулирует специфическую активность клеток пигментированного эпителия. В ходе серии экспериментов, убирая различные белки как в мышиной модели, так и в клетках человека, мы выявили два ключевых белковых соединения - LHX2 и OTX2 - которые вместе определяют экспрессию многих генов, уникальных для этой ткани. Белки действуют как активаторы транскрипции, связываясь со специфическими регуляторными участками в геноме, чтобы определить, какие гены будут "реализованы" в конкретной клетке».
Следующей задачей было определить точное расположение этих двух белков в геноме. Исследователи использовали инновационную технологию ChIP-seq — метод секвенирования ДНК, выявляющий точки, где белки связываются с ДНК. Проф. Элькон: «Мы обнаружили, что точки связывания двух белков были довольно близки друг к другу. Более того, эти же места в геноме оказались отмечены в ходе ранних исследований сравнения генома лиц с AMD и без нее (они находились среди выявленных аномальных участков генома пациентов с AMD).
Мы предполагаем, что из-за изменений в последовательностях ДНК в этих областях генома транскрипционные белки теряют способность эффективно закрепляться на своих точках связывания. Это, в свою очередь, снижает экспрессию соседнего гена, регулируемого этими белками, который и кодирует ионный канал, известный своей важностью для нормального функционирования нашего глаза. Снижение активности гена влияет на всю ткань, увеличивая риск развития AMD».
«Результаты нашей работы обеспечивают новый взгляд на нерешенную до сих пор проблему: функции и способ работы геномных последовательностей, расположенных вне генов, и их влияние на сложные генетические заболевания. Мы считаем, что наша новая методология позволит идентифицировать и "нанести на карту" многие другие генетические механизмы, связанные с AMD и другими комплексными генетическими заболеваниями».